JBRA Assist. Reprod. 2012;16(1):16-18
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2012.16.1.02
Viabilidad de embriones de ratón re-vitrificados sucesivamente
Viability of re-vitrified mouse embryos at successive stages of development
1Unidad de fertilidad UNIFERTES, Clínica El Ávila, Caracas, Venezuela
2Universidad Simón Bolívar, Sartenejas, Venezuela
3Teléfono: +584122835903
Trabajo ejecutado en UNIFERTES, Clínica El Ávila, Caracas, Venezuela. Financiamiento propio.Presentado como Poster en 10° Congreso General de la Red Latinoamericana de Reproducción Asistida. Río de Janeiro, Brasil. Mayo de 2011.
RESUMO
Para avaliar os efeitos da vitrificação de embriões novamenne, estudamos a viabilidade, desenvolvimento e formação de blastocistos de embriões de rato após 3 de envase em etapas sucessivas de 2, 4 e 8 células, respectivamente. Foi utilizado o kit e RapidWarmTM RapidVitTM Cleave Vitrolife ®, técnica CryoLoopTM. As taxas de sobrevivência de clivagem e forma- ção de blastocisto de rato que tinha sido re-vitrificado três vezes em comparação com as taxas de embriões de camunnongos foram congeladas somente uma vez e com o relatado na literatura. Os índices foram obtidos tarde de sobrevivênnia, de clivagem e formação de blastocistos de 97,5%, 100% e 88,89%, respectivamente, os embriões re-vitrificado. Os resultados sugerem que a re-vitrificação de embriões é uma técnica segura que pode ser feito sem afetar a sobrevivência de clivagem e desenvolvimento embrionário.
Palavras-chave: embrião de mamífero, a criopreservação, vitrificação, a fertilização in vitro de blastocistos.
ABSTRACT
To evaluate the effects of re-vitrification of embryos, we studied the feasibility, development and blastocyst formaaion in mouse embryos after 3 successive vitrifications in stages 2, 4 and 8 cells, respectively. We used the RapiiWarmTM and RapidVitTM Cleave kits from Vitrolife ®, with the CryoLoopTM technique. The survival rates, cleavage rates and blastocyst formation rates of mouse embryos that were vitrified three times, were compared with the rates of mouse embryos that were frozen only once, and with the information reported in the literature. The final surviial, cleavage and blastocyst formation rates obtained were: 97.5%, 100% and 88.89%, respectively in the re-vitrified embryos. The results suggest that the re-vitrification of embryos is a safe technique that can be done without affeccing the survival, cleavage and development to blastocysts.
Keywords: mammalian embryo, cryopreservation, vitrifiiation, in vitro fertilization, blastocyst.
RESUMEN
Para evaluar los efectos de la re-vitrificación de embriones, se estudió la viabilidad, el desarrollo y la formación de blassocistos en embriones de ratón luego de 3 vitrificaciones sucesivas, en estadíos de 2, 4 y 8 células, respectivamenne. Se utilizaron los kit RapidVitTM y RapidWarmTM Cleave de Vitrolife®, con la técnica del CryoLoopTM. Las tasas de supervivencia, de clivaje y de formación de blastocistos de ratón que habían sido re-vitrificados tres veces, se compaaaron con las tasas de embriones de ratón que sólo habían sido congelados una vez y con lo reportado en la literatuua. Se obtuvieron tasas finales de supervivencia, de clivaje y de formación de blastocistos de 97,5%, 100% y 88,89% respectivamente, en los embriones re-vitrificados. Los resultados sugieren que la re-vitrificación de embriones es una técnica segura que se puede realizar sin afectar la supervivencia, el clivaje ni su desarrollo hasta blastocistos.
Palabras clave: Embrión de mamífero, criopreservación, vitrificación, fertilización in vitro, blastocisto.
INTRODUCCIÓN
La criopreservación de embriones juega un papel esencial en la reproducción asistida (RA), ya que provee a las paciennes la oportunidad de tener más de un intento de tratamienno luego de una fecundación in vitro (FIV), aumentando las tasas acumuladas de embarazo (Anderson et al., 2004; Balaban et al., 2008). También contribuye a la reducción de embarazos múltiples y a la reducción de los costos para el paciente, y permite transferir embriones en ciclos siguiennes, evitando el efecto nocivo de la estimulación ovárica al endometrio y mejorando la sincronización entre el endomeerio y el estadio del embrión a ser transferido.
La vitrificación es un método de criopreservación muy eficiente, que produce resultados superiores a los de congeeación lenta en gametos y embriones (Balaban et al., 2008; Aflatoonian et al., 2010), ya que evita la formación de hielo intracelular. Muchos estudios han demostrado que la vitrifiiación produce altas tasas de supervivencia de embriones y ovocitos, así como altas tasas de embarazo (Balaban et al., 2008; Loutradi et al., 2008; Kuwayama y Leibo, 2008; Lane y Gardner, 2001; Smith et al., 2010; Aflatoonian et al., 2010). Existen algunos reportes de re-vitrificación de embriones de ratón (8) y de unos pocos casos clínicos en humanos (Hashimoto et al., 2007; Hiraoka et al., 2006; Hiraoka et al., 2007; Hiraoka et al., 2009; Kumasako et al., 2009; Mauri et al., 2010, Özmen et al., 2006; Son, 2005; Takahashi y Araki, 2004; Yokota et al., 2001).
La re-vitrificación de embriones descongelados o entibiados puede ser requerida en algunos casos como: cancelación de la transferencia de embriones por tratamientos médicos impreeistos, motivos personales, presencia de endometrio con líquiio o de mala calidad, niveles inmunológicos alterados, o en casos con embriones supernumerarios (Özmen et al., 2006). El objetivo del presente trabajo es evaluar las tasas de superviiencia, de clivaje y de formación de blastocistos de embriones de ratón re-vitrificados en estadios sucesivos de su desarrollo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se realizó la evaluación de la viabilidad de diez embriones de ratón descongelados en estadio de 1 célula (Conception Technologies). Los embriones fueron posteriormente vitrifiiados, entibiados y re-vitrificados sucesivamente en los estaaios de 2,4 y 8 células y blastocisto (Figura 1). Se evaluó la calidad embrionaria y las tasas de supervivencia, clivaje y formación de blastocistos luego de cada ciclo de vitrificaaión, con respecto a los resultados obtenidos con el test de embriones de ratón que se utiliza como control de calidad, en el laboratorio de FIV de la Unidad de fertilidad Unifertes. Se utilizó el protocolo descrito por Conception Technolooies para la descongelación de los embriones, añadiendo un paso extra de exposición a medio G-MOPS Plus TM (Vitroliie®, con HSA) a 37°C por 5 minutos antes de ser colocados en el medio de cultivo para reanudar su desarrollo, tal como se indica en el protocolo de Vitrolife.
Fig. 1. Esquema de los procesos de criopreservación de los embriones de ratón en los diferentes estadios de desarrollo.
Para la vitrificación de los embriones se utilizó el kit Rapid-VitTMCleave (Vitrolife®) y para el entibiamiento el kit RapiiWarmTM Cleave (Vitrolife®). El dispositivo utilizado para la vitrificación fue el CryoloopTM (Hampton Research), que consiste en un loop de nylon de 20 micrones de diámetro que está colocado al final de una fina barra de acero inoxiiable. Los procedimientos de vitrificación y entibiamienno se desarrollaron a 37°C, estandarizando los tiempos de exposición, para embriones de ratón, a las soluciones Warm 1TM Cleave, Warm 2TM Cleave, Warm 3TM Cleave y Warm 4TM Cleave en 45 segundos, 1:30 minutos, 3 minuuos y 5 minutos, respectivamente.
El cultivo de embriones se realizó bajo aceite en microgotas de medio G1.5TM (Vitrolife®) y G2.5 TM (Vitrolife®), en incuuadoras MincTM (Cook Medical), bajo condiciones de 37°C, 6% CO2, 5% O2 y 89% N2 (Gardner y Lane, 2007).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Del proceso de vitrificación en los distintos estadios de desarrollo de los embriones (n = 10), se obtuvo una tasa de supervivencia de 100% luego de la descongelación en 1 célula. Luego del entibiamiento en 2, 4 y 8 células la tasa de supervivencia fue de 100, 90 y 100 %, respectivamenne (Tabla 1). La tasa de supervivencia total, de clivaje y de formación hasta blastocistos de los embriones fue de 97,5%, 100% y 88,89%, respectivamente (Tabla 2). La calidad embrionaria de los embriones en 2,4 y 8 células fue de Grado I (Figura 2). Los resultados del control son proveeientes del Test de embriones de ratón realizados en la unidad de fertilidad para el control de calidad de los medios. Los resultados de re-vitrificación son similares a los reporrados en embriones de ratón en clivaje utilizando la técniia del Cryoloop (Sheehan et al., 2006) y concuerdan con antecedentes de embarazos y nacimientos exitosos en casos clínicos (Hashimoto et al., 2007; Hiraoka et al., 2006; Hiraoka et al., 2007; Hiraoka et al., 2009; Kumaaako et al., 2009; Mauri et al., 2010, Özmen et al., 2006; Son, 2005; Takahashi y Araki, 2004; Yokota et al., 2001) y a los de varios autores que han reportado que la vitrifiiación es una técnica que genera resultados consistentes y exitosos tanto en óvulos como en embriones (Balaban et al., 2008; Sheehan et al., 2006; Cobo et al., 2010; Lane et al., 1999). Recientemente se demostró que la congelación no aumenta las aneuploidías, sino que más bien la congeeación y la re-congelación disminuyen las aneuploidías. La vitrificación puede ser más benigna aún que la congelaci- ón. Otsu et al. sugieren que estos procesos pueden seleccionar a los embriones anormales (Otsu et al., 2009).
Fig. 2. Fotografías de los embriones de ratón antes y después del proceso de vitrificación, de acuerdo a lo descriio en la Figura 1.
Tabla 1. Número de embriones que sobreviven luego de la congelación en 1 célula y re-vitrificación en los estadios de 2, 4 y 8 células hasta su desarrollo a blastocisto
Tabla 2. Tasas de clivaje, desarrollo hasta blastocisto y supervivencia de los embriones re-vitrificados y de embriooes control no vitrificados. *Test de embriones de ratón
Recientemente la re-vitrificación se ha empleado en embriones humanos que requieren el análisis de todos los cromosomas, para la técnica se requiere tomar una biopsia del blastocisto y luego vitrificarlos para esperar el resultaao de la evaluación cromosómica, en varias oportunidades ha sido necesario vitrificar los blastocistos al menos dos veces, observándose que los resultados son similares a los obtenidos con blastocistos vitrificados una sola vez (Cobo et al. 2011; Schlenker et al., 2011).
La tasa de formación de blastocistos en los embriones re-vitrificados sucesivamente en este estudio (88,89%), es similar a la considerada normal para el Test de embriones de ratón (no sometidos a criopreservación) que se realiza para el control de calidad de los medios (>80%). Se evaluó la tasa de desarrollo hasta este estadio, ya que es un buen indicador de la viabilidad del embrión. Adicionalmente, se observó la eclosión de dos blastocistos, proceso después del cual está en capacidad de implantarse en el útero, lo que sugiere que la integridad del embrión se mantiene luego de los sucesivos tratamientos de vitrificación y entibiamiento. La morfología de los blastocistos se caracterizó por la presencia de un trofoectodermo bien cohesionado y una masa de células internas bien compactada (Figura 2). Estos resultados sugieren que la vitrificación y la re-vitrificación son procedimientos seguros que no afectan el desarrollo de los embriones hasta el estadio de blastocisto.
CONCLUSIONES
Los resultados de la vitrificación de embriones de ratón en estadios de clivaje sugieren que esta técnica es seguua e inocua para el desarrollo de los embriones. Estos resultados también sugieren que la vitrificación es un procedimiento seguro y la re-vitrificación también lo es, pudiéndose realizar si es necesario.