JBRA Assist. Reprod. 2022;16(02):91-93
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2012.16.2.05
Viabilidade de embriões de camundongo (Mus musculus) frescos e vitrificados mantidos por tempos diferentes a temperatura ambiente
Viability of mouse embryos (Mus musculus) fresh and vitrified exposed to different times at room temperature
1Conceber - Centro de Medicina Reprodutiva - Curitiba, Paraná
2Universidade do Vale do Itajaí - UnIVALI - Itajaí, Santa Catarina
Trabalho realizado na Universidade do Vale do Itajaí - SC
RESUMO
Introdução: A manutenção de embriões é um fator importante para o transporte a distâncias variadas e sua posterior utilização.
Objetivo: Testar a viabilidade de embriões de camunnongo frescos e vitrificados/aquecidos expostos à tempeeatura ambiente por diferentes períodos.
Métodos: Fêmeas de camundongo foram estimuladas por dois dias com eGH, receberam hCG ao final do segundo dia e colocadas com machos, após a confirmação da cópulas os embriões foram lavados da tuba uterina no terceiro dia de desenvolvimento e separados em 6 grupos.
Resultados: Embriões frescos expostos à temperatura ambiente por 12 horas (grupo 2) tiveram taxa de blassocisto igual ao controle (grupo 1). Já ao manter embriões por 24 horas (grupo 3) houve uma pequena queda na viabilidade. O processo de vitrificação não ocasionou redução na taxa de blastocisto, quando comparado com o grupo 1. Porém, ao manter embriões vitrificados por 12 ou 24 horas (grupos 5 e 6) a taxa de blastocisto teve uma redução, quando comparado ao controle (grupo 4). Quando embriões frescos ou vitrificados/aquecidos foram expostos à temperatura ambiente por 24 horas (grupos 3 e 6), a taxa de blastocisto foi menor do que embriões mantidos por 12 horas (grupos 2 e 5). Este método de preservação por curtos períodos se mostrou adequado para transporte de embriões frescos por 12 a 24 horas e para embriões vitrificados por 12 a 24 horas, mesmo que com taxas de blastocisto reduzidas.
Conclusão: Este estudo mostra que é viável manter embriões frescos por 12horas com nenhuma perda de viabilidade, enquanto manter embriões vitrificados/aqueeidos acarreta em uma pequena perda de viabilidade, porém sem prejudicar o desenvolvimento in vitro.
Palavras-chave: Reprodução animal, Embrião, Blastooisto, Temperatura ambiente, Transporte.
ABSTRACT
Introduction: The maintenance of embryos is an imporrant factor for the transport distances between them and their subsequent use.
Objective: To test the viability of mouse embryos fresh and vitrified/warmed exposed at room temperature for different periods.
Methods: Female mice were stimulated for two days with eGH, received hCG at the end of the second day and placed with males, after confirmation of mating, embryos were flushed from the oviduct on the third day of development and separated into six groups.
Results: fresh embryos exposed to ambient temperature for 12 hours (group 2) had the same blastocyst rate (group 1). To keep the embryos for 24 hours (group 3) there was a slight decrease in viability. The vitrification process did not reduce the rate of blastocyst compared with group 1. However, by maintaining vitrified embryos for 12 or 24 hours (groups 5 and 6) the rate of blastocyst was reduced when compared to control (Group 4). When fresh or vitrified/warmed embryos were exposed to room temperature for 24 hours (groups 3 and 6), the blastocyst rate was smaller than embryos kept for 12 hours (group 2 and 5). The preservation method for short periods is adequate for the transport of fresh embryos for 12-24 hours and for embryos vitrified for 12-24 hours, even with a small reduction in blastocyst rates.
Conclusion: This study shows that it is possible to keep fresh embryos for 12 hs with no loss of viability, Meanwhile, maintaining vitrified/warmed ones leads to a small loss of viability but without harming the development in vitro.
Keywords: Animal reproduction, embryo, blastocyst, Ambient, Transportation.
INTRODUÇÃO
A produção de embriões murinos é fundamental para o desenvolvimento de diversas áreas da ciência através do aprimoramento de técnicas e protocolos. O intercâmbio de embriões é mais vantajoso do que enviar e receber animais, pois facilita a logística envolvida e apresenta custo menor (Bilton & Moor, 1977). Porém quando o laboratório receptor não possui o domínio das técnicas de aquecimento ou não dispõe de equipamentos para manter os embriões estocaaos, é conveniente o envio de embriões frescos. Além disso, esses procedimentos requerem uma infraestrutura míniia e conhecimento técnico para serem realizados (Tada et al.,1990; nakagata e Takeshima 1992).
Uma vantagem do domínio dos métodos de criopreservação é a possibilidade de formar bancos de embriões, com isso é possível preservar o material genético de espécies com alto valor zootécnico (Kuleshova & Lopata, 2002). Porém o processo de criopreservação tem normalmente efeitos negativos como a perda da viabilidade do embrião (Gordon, 1994). Outro efeito negativo é causado pelos crioprotetooes usados nos processos de vitrificação é por vezes efeito tóxico sobre os embriões (Rall & Fahy, 1985). Desta maneiia, processos de resfriamento e manutenção de embriões à temperatura ambiente são alternativas que atendem a certas necessidades, possibilitando o transporte a distâncias variadas, reduzindo os custos e dispensando os processos de criopreservação, além de minimizar a perda da qualidade embrionária (Leibo & Winninger, 1986).
O objetivo deste trabalho foi verificar a viabilidade dos embriões expostos à temperatura ambiente após criopreserração e a fresco, buscando alternativas para o transporte de embriões para finalidades diversas.
MATERIAIS E MÉTODOS
Superovulação e coleta dos embriões
Foram utilizadas fêmeas de camundongo F1 (C57bl/6 x Swiss). Os animais foram mantidos a temperatura de 22+ 2°C e ciclo de luz 12/12h (claro/escuro). Fêmeas com 4 a 5 semanas foram superovuladas através da administração intraperitoneal de 5 UI eCG (novormon - Synthex) e após 48h com 5 UI hCG (Vetecor - Calier). Após a injeção de hCG, as fêmeas foram colocadas com machos da linhagem swiss durante a noite. na manhã do dia seguinte, após observação da presença do tampão vaginal foram separadas dos machos. no dia +3 as fêmeas foram sacrificadas por deslocamento cervical. Os embriões foram lavados da tuba uterina com meio HTF-Hepes + 10% de SFB (soro fetal boviio). Os embriões foram selecionados utilizando-se como critério de avaliação sua morfologia, regularidade dos blastômeros e grau de compactação. Após a seleção, os embriões foram separados em seis grupos.Grupos (Figura 1):Grupo 1: Após a coletas os embriões deste grupo foram separados em gotas e imediatamente transferiios para a placa de cultura.Grupo 2: Os embriões deste grupo permaneceram expostos a temperatura ambiente por 12 horas envasados em palhetas de 250 µl com meio HTF-Hepes + 10% de SFB. As palhetas foram colocadas em um recipiente de isopor à temperatura ambiente (25ºC ± 2ºC) por 12 horas. Após este período, os embriões foram desenvasados e transferidos para cultura em incubadora de CO2.Grupo 3: Os embriões deste grupo foram envasados e permaneceram sob as mesmas condições ambiennais do grupo anterior porém, por um período de 24 horas sendo transferidos para a incubadora de CO2 logo após o desenvase.Grupo 4: Este grupo teve seus embriões vitrificados/ aquecidos. Após este procedimento os embriões foram transferidos para gotas em placas de cultura e levados à incubadora.
Figura 1. Divisão dos grupos e delineamento experimental.
Grupo 5: Para este grupo os embriões foram vitrifiiados e aquecidos. Após o aquecimento, foram envasados em palhetas de 250 µl com meio HTF-Hepes suplementado com 10% de SFB. As palhetas foram colocadas em um recipiente de isopor à temperatura ambiente (25ºC ± 2ºC) por 12 horas. Após este período, os embriões foram desenvasados, agrupados em 15 e transferidos para cultura em incubadora de CO2. Grupo 6: este grupo passou pelo mesmo processo de vitrificação/aquecimento que o grupo 5 porém ficou exposto a temperatura ambiente por 24 horas e só depois deste período foi transferido para placas de cultura e colocado em incubadora de CO2Todos os embriões foram cultivados em grupos de 15 embriões por gota.
Vitrificação
Os embriões foram expostos à solução de equilíbrio VS1 (10% EG +10% DMSO e 0,25M sacarose em HTF-hepes + 10% de SFB) em um volume de 150µl, por 2 minutos. Logo após, transferidos para uma gota de 50µl da solução VS2 (20% de EG + 20% DMSO + 0.5M de sacarose em HTF-hepes + 10% de SFB) por 30 segundos. Foram envasados e imediatamente mergulhadas em n2L.
Aquecimento
As palhetas foram retiradas do nitrogênio líquido, expostas por 20 segundos ao ar ambiente e banhadas em água a temperatura aproximada de 25ºC por 40 segundos. Os embriões foram desenvasados em placas de Petri (35mm) contendo gotas de 100µl de solução de sacarose 0,3M por 5 minutos, em seguida passados a uma gota de 100µl de solução de sacarose 0,15M e por fim ao meio HTF-Hepes + 10% SFB.
Teste de viabilidade in vitro
Os embriões foram colocados em microgotas (40µl) de meio Global (Lifeglobal) + 10% de SFB, sob óleo mineral e mantidos em incubadora a 37°C com 5% CO2 e umidade alta (?). A capacidade de desenvolviiento embrionário até blastocistos foi observada nas primeiras 24 e 48 horas.
Análise Estatística
A taxa de formação de blastocistos in vitro entre os grupos foram comparadas utilizando o teste de chiquadrado (MInITAB InC., 1996). Diferenças com probabilidade menor que 0,05 foram consideradas significativos. A associação entre o desenvolvimento in vitro e tempo de exposição a temperatura ambiente foi avaliada calculando-se a razão de chance (Odds ratio).
RESULTADOS
A taxa de formação de blastocisto foi semelhante para os grupos 1 e 2 (p> 0,09, tabela 1). Contudo esta taxa foi menor no grupo 3 quando comparado ao grupo 1 (73,7 vs 97,7% respectivamente), tabela 1.
A vitrificação dos embriões não alterou a taxa de formação de blastocistos quando comparado com a do grupo 1 (96,2% vs 97,7% respectivamente). Embriões vitrificados/aquecidos, mantidos em temperatura ambiente por 12 ou 24 horas (grupo 5 e 6) tiveram taxas de blastocisto semelhantes, porém, menores que o grupo 4.
A permanência de embriões dos grupos 3 e 6 por 24 horas à temperatura ambiente apresentou taxas de blastocisto semelhantes, porém menores que os embriões dos grupos 2 e 5.
Tabela 1. Taxa de desenvolvimento in vitro de embriões vitrificados e não vitrificados expostos à temperatura ambiente por diferentes períodos.
DISCUSSÃO
Pomar et al. (2004) manteve embriões suínos por 24 horas a 25ºC não obteve resultados satisfatórios (taxa de blastooisto de 13,0%). Oócitos de camundongo preservados a 5ºC por 48 horas apresentaram taxa de fertilização de 66,5% (Tsuchiya et al., 2001). neste mesmo estudo, oócitos preserrados por 24 ou 48 horas a temperatura de 37º apresentaram taxas de fertilidade de 9,6 e 1,6%, respectivamente. Porém, embriões suínos mantidos a 18ºC tiveram uma taxa de degeneração maior que embriões mantidos a temperaauras de 25 ou 38ºC (Pomar et al. 2004). A adição de 0,5 - 0,75 M de um açúcar no meio manutenção pode aumentar a taxa de blastocisto em embriões mantidos a 0ºC (Kasai 1986). Taxas de nascimento vivo de 37%, 32,8% e 29,9% foram observadas quando embriões foram armazenados a 0º C por 24, 48, 72 horas respectivamente (Miyoshi, et al 1992). Outra opção foi demonstrada por Kamimura et al, 2003, onde embriões murinos de duas células foram mantidos dentro da tuba uterina por 36 horas a 4ºC e depois de cultivados foram observadas taxas de 68,3% de blastocisto. Portanto, os resultados do presente estudo somam-se aos já existentes e indicam a possibilidade de conservação de embriões em temperatura ambiente, sem perda significativa de sua viabilidade.
Nos grupos 4, 5 e 6 onde os embriões foram expostos a temperatura ambiente após o aquecimento obserramos que o processo de criopreservação não foi um fator determinante na taxa de formação de blastocissos já que esta foi semelhante ao grupo 1. Provavellente um somatório dos efeitos do tempo de permaaência em temperatura ambiente e a criopreservação causaram a redução observada nas taxas de blastocisso dos grupos 4 e 5.
De acordo com Pedro et al. (2005), embriões no estágio de 8 células e mórulas são mais susceptíveis à penetração de EG e Glicerol e menos ao DMSO. Ao mesmo tempo em que os crioprotetores penetram na célula com facilidade, também tendem a sair com facilidade. O uso de EG associado com DMSO pode ter contribuído para as altas taxas de blastocissos obtidos nos grupos vitrificados. Segundo Kasai (1986), a adição de açúcares em uma concentração mais elevada às presentes neste estudo pode levar a melhores taxas de blastocisto pós vitrificação.
Desta forma, este estudo demonstrou que é possível manter embriões criopreservados e quando necessários, aquecê-los e mantê-los em temperatura ambiente por até 24 horas com uma pequena perda da sua viabilidade. Os resultados deste estudo demonstram que é possível manter embriões murinos por até 12 horas em temperatura ambiente com uma viabilidade semeehante ao controle (grupo 1 e 4). Mesmo quando são mantidos à temperatura ambiente por 24 horas (grupo 3 e 6) sua viabilidade diminui, mas ainda com taxas significativas de formação de blastocistos. Esta opção de manutenção de embriões em condições ambientais mostra-se eficiente para transporte a distância com permanência da qualidade embrionária.
Gordon I. Laboratory production of cattle embryo. Wallinnford: CAB International; 1994.