JBRA Assist. Reprod. 2012;16(03):91-94
RELATO DE CASO
doi: 10.5935/1518-0557.2012.16.3.06
PGD en una portadora de translocación recíproca 4;13 abordado comn QF-PCR múltiple
Fecunditas, Instituto de Medicina Reproductiva afiliado a la UBA
Resultados parciales del presente trabajo fue presentado en VII Congreso Argentino de SAEGRE realizado en Buenos Aires, 18-20 de Abril de 2010
RESUMEN
Se presenta la resolución de un PGD en una portadora de una translocación recíproca de novo (4;13)(q27;q32) utilizando una PCR fluorescente cuantitativa múltiple (QF-PCR) con marcadores polimórficos (STRs) ligados a los brazos largos de los cromosomas involucrados en la translocación.Se trata de una pareja joven con una sola hija normal y tres abortos espontáneos. Previo a la realización del PGD, se ensayaron en el DnA de la pareja una serie de 13 marcadores polimórficos (STRs) ligados a los cromosomas 4, 13 y 21 con el propósito de seleccionar aquellos con alelos diferentes entre ambos miembros de la pareja. Resultaron informativos: D13S796, D13S284 y D4S171, los cuales fueron utilizados para la QF-PCR múltiple conjuntamente con el marcador D21S1411 para enumerar al cromosoma 21. La estimulación ovárica fue realizada con protocolo estándar con agonista GnRh + gonadotrofinas recombinantes + HCG. Se obtuvieron 9 embriones biopsiables al tercer día del desarrollo, constituidos por seis o más blastómeras. Cuatro embriones resultaron de ovocitos con segregación alterna y 5 con segregación adyacente 1. Tres embriones con segregación alterna alcanzaron el estado de blastocisto en día 5. Dos fueron transferidos y uno vitrificado. Se logró un embarazo único. nació un varón normal. Se efectuó cariotipo en sangre de cordón umbilical y se evidenció una constitución 46, XY. Por lo tanto, en los futuros PGD se podría erradicar la translocación ya que ahora se conoce cuales son los STRs ligados a los cromosomas 4 y 13 libres y translocados.La mujer a los 6 meses del nacimiento del niño se embaraza sin planificarlo. Se realiza amniocentesis a las 15 semanas y se realiza la misma QF-PCR múltiple diseñada para el PGD, un array de CGH y cultivo de amniocitos para estudio citogenético. A las 24 hs. de la punción supimos que se trataba de un feto normal translocado, el cual fue corroborado con el cariotipo convencional. La pareja tiene vitrificado un blastocisto con los cromosomas 4 y 13 libres sin trisomía 21. Deberán evaluar en la futura transferencia si desean completar el estudio con el array CGH.
Palabras claves: PGD, diagnóstico genético preimplantacional, QF-PCR, aCGH, cariotipado molecular, PCR fluorescente cuantitativa.
RESUMO
Apresentamos a resolução de um PGD numa portadora de translocação recíproca de novo (4, 13) (q27; q32) múltipla, usando quantitativa PCR fluorescente (QF-PCR) com marcadores polimórficos (STRs) associados com os braços longos dos cromossomas envolvidos na translocação. Trata-se de casal jovem, com uma filha normal e três abortos espontâneos. Antes da realização do PGD, foram testados no DnA do casal uma série de 13 marcadores polimórficos (STRs) ligadas aos cromossomas 4, 13 e 21, a fim de seleccionar aqueles com alelos diferentes entre os dois parceiros. Resultaram informativos os STRs: D13S796, D13S284 e D4S171, que foram utilizados para QF-PCR multiplex, junto com o D21S1411 marcador do cromossomo 21. A estimulação ovariana foi realizada com o protocolo padrão agonista de GnRH gonadotrofinas recombinantes + + HCG. 9 embriões biopsiáveis foram obtidos no dia3 de desenvolvimento, com seis ou mais blastómeros. Resultaram quatro embriões de oócitos com segregação alternativa e 5 com segregação adjacenteadjacente 1. Três embriões com segregação alternativa atingiram o estágio de blastocisto no dia 5. Dois foram transferidos e 1 vitrificado. Houve g ravidez única e nasceu um homem normal. Cariótipo do sangue do cordão umbilical mostrou constituição 46, XY. Portanto, PGDs futuros poderiam erradicar esta translocação, conhecidos os STRs ligados aos cromossomos 4 e 13 livres e translocados. Esta mulher gestou espontaneamente após 6 meses do parto, sem planejamento. A amniocentese foi realizada com 15 semanas ese realizou o mesmo QF-PCR desenvolvido para PGD, além de um array CGH e amniócitos cultivados para estudo citogenético. Em menos de 24horas diagnosticou-se um feto normal, translocado, confirmado por cariotipagem convencional. O casal tem um blastocisto vitrificado com cromossomos 4 e 13 livres, sem a trissomia do 21. numa transferência futura deve-se avaliar se desejam concluir o estudo com o conjunto CGH-array.
SUMMARY
We present the resolution of a PGD in a carrier of a de novo reciprocal translocation (4, 13) (q27, q32) using a multiple quantitative fluorescent PCR (QF-PCR) with polymorphic markers (STRs) linked to the long arms of the chromosomes involved in translocation. This is a young couple with one normal daughter and three spontaneous abortions.Before performing the PGD, in the DnA of the couple we tested a series of 13 polymorphic markers (STRs) linked to chromosomes 4, 13 and 21 in order to select those with different alleles between the two partners.Resulted informative the following STRs: D13S796, D13S284 and D4S171, which were used for QF-PCR multiplex, in conjunction with the marker D21S1411 to enumerate the chromosome 21.Ovarian stimulation was performed with the standard protocol GnRH agonist + recombinant gonadotropins + hCG. nine embryos were biopsied on the third day of development, which had six or more blastomeres. Four embryos resulting from oocytes with alternate segregation and 5 of the adjacent 1 segregation. Three alternate segregation embryos reached the blastocyst stage on day 5, two were transferred and one vitrified. Singleton pregnancy was achieved, and a normal male was born. Karyotype was performed in umbilical cord blood and it showed a 46, XY constitution. Therefore, the couple in futures PGDs could eradicate the translocation, because now we known the STRs linked to chromosomes 4 and 13 free or translocated. Six months after birth the woman became pregnant again,without planning it. Amniocentesis at 15 weeks enabled the same designed QF-PCR multiplex, an array of CGH and the culture of amniocytes for conventional cytogenetic study. In less than a day from the amniocentesis we got to know that the fetus was normal translocated (subsequently corroborated by conventional karyotyping). The couple has a normal blastocyst vitrified with free chromosomes 4 and 13 and without trisomy 21. At the right time they should decide whether to complete the study for all chromosomes performing an array CGH previous to the embryo transfer.
keywords: PGD, preimplantation genetic diagnosis, QF-PCR, aCGH, molecular karyotyping, quantitative fluorescent PCR.
INTRODUCCIÓN
Los portadores de translocaciones reciprocas tienen un riesgo cromosómico teórico de 80% para producir gametos con desbalances de los cromosomas involucrados, y casi siempre el riesgo empírico coincide con el teórico. En una minoría puede ser mucho más bajo o más alto aún (Goldman et al,1993; Martín et al, 1993; Munné et al, 2000 ). Las gametas desbalanceadas no son infecundas y originan cigotos anormales. La mayoría de las segregaciones que implican desbalances importantes son letales en la etapa preimplantatoria, en cambio las que implican desbalances mínimos llegan generalmente a término y dan lugar a nacidos malformados. Como este tipo de rearreglo cromosómico balanceado altera la gametogénesis, los portadores generalmente consultan por infertilidad. El PGD es una alternativa de diagnóstico prenatal, el cual favorece el establecimiento de un embarazo sin desbalance de los cromosomas involucrados en la translocación. Este dato no es menor en Latinoamerica ya que el aborto genético también es penado.
Hasta hace poco la mayoría de los PGDs de portadores de translocaciones recíprocas fueron abordados por FISH (Hibridación in situ Fluorescente) (Munné, 2002), mientras que una minoría por QF-PCR ( PCR fluorescente cuantitativa ) a pesar de las mayores ventajas respecto del FISH (Traversa et al, 2010). Otra minoría por hibridación genómica comparada convencional (mCGH) o con array (aCGH) (Fiorentino et al, 2011). Si bien estos dos últimos métodos permiten detectar desbalances de todos los cromosomas, no permiten conocer la ploidía ni documentar la existencia de translocaciones balanceadas. Comunicamos el PGD por una translocación reciproca t(4;13) por QF-PCR.
PACIENTES y MÉTODOS
Se trata de una pareja joven de 33 años de edad, no consanguínea, con una hija normal y tres abortos espontáneos del primer trimestre, los cuales no fueron estudiados cromosómicamente.
El estudio citogenético de la pareja, evidenció que la mujer es portadora de una translocación recíproca: 46,XX,t(4;13) (q27;q32) (fig 1). El estudio en los padres de la portadora reveló que eran cromosómicamente normales.
Figura 1. Cariotipo parcial de la translocación recíproca
Previo a la realización del PGD se ensayaron en el DnA de la pareja una serie de 13 marcadores polimórficos (STRs) ligados a los cromosomas 4, 13 y 21 con el propósito de seleccionar aquellos con alelos diferentes entre ambos miembros. Resultaron informativos los STRs D13S796, D13S284 ,D4S171, D21S1411, los cuales fueron utilizados para la QF-PCR múltiple (ver fig2 y tabla 1).
Figura 2. Esquema de las translocación y ubicación de STRs informativos
Tabla 1. STRs informativos hallados en la pareja
La estimulación ovárica fue realizada con protocolo estándar agonista GnRh + gonadotrofinas recombinantes + HCG. La aspiración de los folículos ováricos se realizó por vía ecográfica con anestesia local y neuroleptoanalgesia. Se recuperaron los ovocitos de los fluidos foliculares aspirados y a los ovocitos maduros se les realizó la ICSI. Se obtuvieron 9 embriones biopsiables al tercer día del desarrollo, constituidos por seis o más blastómeras.
Los embriones sin desbalances fueron transferidos en el quinto día al estado de blastocisto. La suplementación de la fase lútea fue realizada con gel de progesterona.
Para la biopsia se perforó la membrana pelúcida con micro disparos de rayos láser cercano a la blastómera elegida para extraer, la que fue aspirada con ayuda de una micropipeta succionadora y posteriormente colocada en un tubo de PCR en un volumen de 1 μl del medio de biopsia, el cual fue guardado en el freezer hasta efectuar la lisis de la célula.
La lisis se efectuó en un buffer conteniendo 10X PCR buffer, tween20 1%, tritonX100 1% y proteinasa K 20 μg/ul , primero a 45°C/20 minutos y luego 96°C /20 minutos. Al producto de lisis se le realizó la QF_PCR múltiple diseñada. La mezcla de reacción fue 5X PCR buffer, dNTPs 10 mM, 0,5 μM de cada uno de los STRs (ver tabla 2) y Taq polimerasa 5 U/μl . Las condiciones de ciclado fueron 95°C/ 5min. seguido de 35 ciclos a 95°C/5 min, 50°C/30seg. 72°C /30seg. con una extensión final a 72°C/5min. Los amplicones obtenidos fueron analizados por electroforesis capilar en un ABIprism 310.
RESULTADOS
En la tabla 3 figuran los resultados de los STRs hallados en cada uno de los embriones estudiados, luego de la QF-PCR múltiple realizada en las blastómeras de cada uno de los embriones biopsiados.
Si a los STRs de los cromosomas 4 y 13, tanto los libres como los translocados, los denominamos M1, M2, M3, M4, M5 y M6 como aparece en la fig. 3 podremos conocer el tipo de segregación que ocurrió durante la anafase 1. Los embriones 1, 2 y 8 tienen un patrón de segregación alterna; los embriones 3, 4, 5, 7 y 9 el patrón de segregación adyacente 1, mientras que el embrión número 6 sólo evidenció los STRs maternos, como si se tratara de una haploidía, pero compatible con un patrón de segregación alterna.
Tabla 2. Primers 3´- 5´ de los STRs usados en la multiplex
Tabla 1. STRs informativos hallados en la pareja
Los embriones 1, 2, 8 alcanzaron el estado de blastocisto al quinto día. El embrión 6 quedó detenido en 6 células. Dos de los cinco embriones con segregación adyacente alcanzaron el estado de blastocisto ( embriones 7 y 9). La paciente fue transferida con los embriones 1 y 2, logrando un embarazo simple que culminó en el nacimiento de niño normal de sexo masculino.
Como se aprecia en la tabla 2, los STRs de los cromosomas 4 y 13 maternos de los dos blastocistos transferidos eran diferentes. Uno tenía los STRs M1, M3 y M5, y el otro los STRs M2, M4 y M6.
Al nacimiento se tomó sangre de cordón para estudio del cariotipo y de los STRs utilizados en la QF-PCR diseñada para el PGD. El cariotipo evidenció una constitución 46,XY y los STRs de los cromosomas 4 y 13 de origen materno fueron: M1, M3 y M5. Por lo tanto, esos STRs están ligados a los cromosomas 4 y 13 libres de la madre.
DISCUSIÓN
La mayoría de los PGDs por translocación recíproca fue resuelta por FISH usando como mínimo dos sondas enumeradoras y una telomérica de uno de los cromosomas involucrados. El presente PGD fue por QF-PCR. Ambas metodologías permiten distinguir la segregación alterna normal de las otras segregaciones anormales, pero la QF-PCR en las translocaciones familiares, permite diferenciar si la segregación balanceada es portadora de la translocación, además de permitir conocer en qué anafase meiótica ocurrió la aneuploidía y el origen materno o paterno del error meiótico. El reconocimiento del origen es importante desde el punto de vista académico sobre todo cuando se quiere inferir la existencia de otras aneuploidías por efecto intercromosómico (Micman et al, 2008).
Está reconocido que el riesgo empírico en la mayoría de las translocaciones recíprocas coincide con la posibilidad teórica de las cinco segregaciones posibles, de las cuales cuatro son anormales y una sola normal, o sea que el 80% de las gametas son anormales (Coco et al, 2005). En el presente caso, de 9 embriones estudiados 4 fueron balanceados ( 44%). Por lo tanto, se podría decir que la translocación tuvo un comportamiento más benévolo de lo esperado. no fue posible diferenciar en los embriones que resultaron de segregación alterna del cuadrivalente, cual de las dos posibilidades correspondía a los cromosomas 4 y 13 libres y cual a los translocados, debido a que la translocación fue de novo en madre.
Figura 3. Posibilidades de segregación del cuadrivalente meiótico durante la anafase 1.
Si bien no fue posible para el presente PGD, cuando nació el niño el estudio del cariotipo y la QF-PCR en la sangre de cordón permitió reconocer los STRs ligados a los cromosomas 4 y 13 libres. Este dato adquiere importancia sobre todo si la pareja quiere erradicar la translocación balanceada en futuros hijos accediendo a un PGD con la QF-PCR múltiple diseñada originalmente. La mujer a los 6 meses del nacimiento del bebé quedó embarazada sin planificarlo. A las 15 semanas de gestación accedió al estudio prenatal por amniocentesis. El liquido amniótico extraído ( 20 ml) se dividió en tres partes. Una fue cultivada para estudio citogenético convencional. A las otras dos se les extrajo el ADn y se realizó la QF-PCR múltiple diseñada y el array de CGH (hibridación genómica comparada) 24 sure plus de Bluegnome®. En forma ultrarrápida tuvimos los resultados de la QF-PCR y el aCGH .
El aCGH nos permitió inferir que el feto tenía un cariotipo masculino normal sin desbalances, mientras la QF-PCR que era portador de la translocación balanceada ya que los STRs ligados a los cromosomas 4 y 13 maternos eran los M2, M4 y M6. A los 15 días ambos resultados fueron corroborados con el cariotipado convencional logrado con el cultivo de los amniocitos.
La necesidad de realizar estudios genéticos en una única célula o en pocas ha hecho que se desarrollara nuevas metodologías que lo permitiera, sin embargo esas metodologías también pueden ser utilizadas en los diagnósticos genéticos prenatales, sobre todo para aquellas embarazadas con signos de alarma ecográficos detectados al comienzo del primer trimestre.
La pareja aún conserva un blastocisto normal vitrificado con los cromosomas 4 y 13 libres y sin trisomía 21. Cuando decida la transferencia se le informará sobre la posibilidad actual del aCGH que permitiría descartar toda posibilidad de otras aneuploidías por o sin efecto intercromosómico (Coco et al,2008; Gianaroli et al,2002; Pujol et al, 2003).