JBRA Assist. Reprod. 2012;16(5):282-285
ARTIGO DE REVISÃO
doi: 10.5935/1518-0557.2012.16.5.05
1Doutoranda em Ciências da Saúde - UFG, Laboratório de Reprodução Humana, Hospital das Clínicas, Universidade Federal de Goiás
2Mestre em Ciências da Saúde - UFG, Laboratório de Reprodução Humana, Hospital das Clínicas, Universidade Federal de Goiás
3Professor titular do Departamento de Gineco-Obstetrícia da Faculdade de Medicina e orientador no Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde, Diretor do Laboratório de Reprodução Humana, Hospital das Clínicas, Universidade Federal de Goiás
Trabalho realizado no Laboratório de Reprodução Humana do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás. não há conflitos de interesse.
RESUMO
Embora a Fertilização in vitro tenha sido estabelecida com sucesso nas últimas décadas do século XX, a sua história é muito mais antiga. Vários estudos de diferentes partes do mundo contribuíram para o entendimento do processo reprodutivo e para o desenvolvimento das Técnicas de Reprodução Assistida. Durante as últimas décadas, pesquisas contribuiram para o avanço dessas técnicas. Fertilizar oócitos in vitro permitiu a compreensão dos mecanismos da fertilização e do desenvolvimento embrionário inicial. Este estudo realizou uma revisão histórica dos experimentos que ajudaram no desenvolvimento da área e do conhecimento científico.
Palavras-chave: técnicas reprodutivas, inseminação artificial, fertilização in vitro, ICSI, injeção intracitoplasmática de espermatozóides.
ABSTRACT
Although IVF has been successfully established in the last decades of the twentieth century, its history is much older. Several studies from different parts of the world contributed to the understanding of the reproductive process and the development of assisted reproductive techniques. During the last decades, research has contributed to the advancement of these techniques. Fertilize oocytes in vitro allowed the understanding of the mechanisms of fertilization and early embryonic development. This study performed a historical review of experiments that helped in developing the area and scientific knowledge.
Keywords: reproductive techniques, insemination artificial, in vitro fertilization, ICSI, intracytoplasmic sperm injections.
INTRODUÇÃO
O primeiro relato sobre infertilidade esta no livro de Gênesis (17:17-21:02) na Bíblia, que descreve o caso de Sara e Abraão. Depois de receber a intervenção divina, Sara dá a luz ao filho Isaque aos 90 anos e o pai Abraão com 100 anos. Existem também hieróglifos sobre deuses da fertilidade no Egito e, na Roma antiga a infertilidade era uma razão aceitável para pedir o divórcio.
Embora a Fertilização in vitro (FIV) tenha sido estabelecida com sucesso nas últimas décadas do século XX, a sua história é muito mais antiga. Vários estudos de diferentes partes do mundo contribuíram para o entendimento do processo reprodutivo e para o desenvolvimento das Técnicas de Reprodução Assistida (TRA).
O objetivo do presente trabalho foi realizar uma revisão histórica da literatura sobre estudos importantes que levaram ao desenvolvimento das técnicas de reprodução assistida.
PRINCÍPIO DA REPRODUÇÃO ASSISTIDA - INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL
Os primeiros relatos sobre reprodução assistida foram encontrados em um documento do ano de 1322 que faz referência aos povos árabes que realizavam procedimentos de inseminação artificial com objetivo de criar cavalos mais fortes e resistentes ao calor para a locomoção no deserto. Alguns séculos mais tarde, a primeira inseminação foi descrita cientificamente pelo padre italiano Lázaro Spallanzani, estudante de ciências naturais. Em 1779, colheu sêmen de um cão que circulava pelas imediações do mosteiro e introduziu manualmente no trato reprodutor de uma cadela de estimação durante o período do cio, a qual pariu três filhotes (Graciano, 2002).
Na espécie humana o primeiro relato é atribuído ao médico inglês John Hunter num caso de hipospádia grave em 1790. Muitas tentativas foram feitas após esta data, sendo que o primeiro sucesso ocorreu em 1838 pelo médico francês Girault (Kotecki, 2004). Em 1865 o médico francês F. Dehaut fez a primeira publicação científica sobre o assunto. No ano de 1866, o ginecologista francês Jaime Marion Sims obteve sucesso com a inseminação artificial cientificamente documentada, e em 1884 o médico inglês Pancoast foi o primeiro a realizar a inseminação heteróloga, indicada para azoospermia pós-gonocócica (Graciano, 2002).
A Inseminação Artificial transpõe bloqueios no trato genital inferior, que impedem o transporte dos gametas masculino, colocando-os mais próximos do encontro com o oócito, já que apenas 10% dos espermatozóides móveis adentram na cavidade uterina. Por ser considerada uma técnica simples, várias experiências foram realizadas como a deposição de gametas masculinos no trato reprodutivo feminino. Inicialmente foram utilizadas no tratamento de problemas que impediam a cópula, como vaginismo ou defeitos anatômicos penianos (Kotecki, 2004).
O SURGIMENTO DA FERTILIZAÇÃO IN VITRO
A primeira tentativa de FIV foi realizada pelo embriologista vienense Leopold Samuel Schenk em 1878 estudando coelhos. Schenk observou a ruptura de células da granulosa após adicionar esperma coletado do epidídimo a folículos suspensos em fluido folicular e muco uterino. Entretanto, não houve êxito na fertilização (Pincus & Enzmann, 1937). E esse experimento incentivou à descoberta de hialuronidase no esperma, décadas depois (McClean & Rowlands, 1942). Em 1891 o fisiologista inglês Walter Heape demonstrou que oócitos de coelha já fertilizados forneciam embriões que poderiam ser recuperados diretamente das trompas e transferidos para uma mãe receptora. A cultura de oócitos foi reconhecida como uma possibilidade favorável no fim do século XIX. Cientistas dessa mesma época já faziam idéia de que o sangue carreava substâncias que afetavam a saúde e o termo “hormônio” foi cunhado apenas em 1905 por William Maddock Bayliss e Ernest Henry Starling (Rohden, 2008). Lewi e Greving, por volta de 1920, caracterizaram o eixo hipotálamo-hipofisário e desvendaram os hormônios essenciais para a fertilidade feminina: hormônio folículo estimulante (FSH - Follicle-Stimulating Hormone), hormônio luteinizante (LH - Luteinizing hormone) e hormônio gonadotrofina coriônica humana (hCG - human Chorionic Gonadotropin) (Rohden, 2008).
O biólogo americano Gregory Goodwin Pincus estudou oócitos de coelhas e em 1934 publicou, com o colega Ernst Vinzenz Enzmann, os primeiros experimentos sobre FIV, no qual afirmavam ter produzido a primeira gravidez bem sucedida. no entanto, análises posteriores do estudo sugeriram que a fertilização ocorreu tecnicamente in vivo e não in vitro, já que os oócitos transferidos foram fertilizados, provavelmente, na trompa da coelha receptora; procedimento conhecido como GIFT - Gamete Intra-Fallopian Transfer (Pincus & Enzmann, 1937). Este estudo permitiu novas idéias sobre as fases de maturação dos oócitos de coelhas obtidos diretamente dos ovários, visto que durante o experimento eles observaram diferentes estágios de folículos. Pincus ficou conhecido também pelo desenvolvimento da pílula anticoncepcional mais tarde na década de 50, juntamente com Carl Djarassi.
Após experiências com modelos animais, as primeiras observações em humanos foram relatadas pelo médico John Rock e seu colaborador Arthur Hertig em 1938 quando analisavam histerectomias realizadas logo após a ovulação na esperança de observar oócitos fertilizados. Em colaboração com a assistente Mirian Menkin, em 1944, oócitos não fertilizados foram cultivados na presença de esperma coletado de estagiários do Dr. Rock, e ao final do período de incubação observaram blastômeros regulares. Em 1948, expuseram oócitos a espermatozóides in vitro e notaram clivagem em quatro oócitos, porém nenhuma transferência foi realizada. Após quatro anos de pesquisa, o projeto foi abandonado por ser considerado impossível (Menkin & Rock, 1948).
Em 1951, Min Chueh Chang nos Estados Unidos e Colin Russell Austin na Austrália notaram que os espermatozóides necessitavam de uma etapa prévia para a fertilização, surgindo novas idéias sobre a capacitação espermática (Austin, 1951; Chang, 1951). novos métodos de preparo do sêmen foram pesquisados proporcionando o processamento espermático - espermatozóides separados do plasma seminal, aumentando a concentração dos espermatozóides móveis (Chang, 1959; Edwards, 2004). Até esse ponto da história os critérios que confirmavam que o oócito havia sido fertilizado pelo espermatozóide variavam desde a emissão do segundo corpúsculo polar, a formação de pró-núcleos e a clivagem. Devido a essa falta de padronização das definições de “fertilização” e “concepção”, as taxas de sucesso variavam significantemente causando confusão.
O biólogo britânico Robert Geoffrey Edwards professor na Universidade de Cambridge, acredita que o que frustrou os trabalhos de pesquisadores como Menkin e Rock foi a não-compreensão do conceito de capacitação do sêmen, elucidado posteriormente por Chang. Edwards conduzia seus estudos sobre embriologia de mamíferos, investigava a ovulação em ratos fêmea e também as primeiras observações de oócitos humanos em diferentes estágios de maturação in vitro (Edwards, 1965; 2004).
Havia uma dificuldade em conseguir mais oócitos por ciclo que, até este momento, eram ciclos naturais. Edwards percebeu que os espermatozóides eram abundantes enquanto que o oócito não e, a partir desse fato, estudou a sincronização de oócitos para obter um número maior disponível para recuperação em ratos fêmea, originando uma série de estudos sobre controle da ovulação induzida por uso de hormônios exógenos (Fowler & Edwards, 1957). Trabalhando em conjunto com Alan Gates, descreveram uma sequência de eventos que levava a ovulação após a injeção hCG extraído de éguas prenhas, o que induzia os oócitos a amadurecerem num tempo previsível (Edwards & Gates, 1959). Em colaboração com o ginecologista Patrick Christopher Steptoe, estudaram a recuperação de oócitos inicialmente através de laparoscopia utilizada no tratamento da síndrome dos ovários policísticos, com ressecção em cunha dos ovários. Essa colaboração começou em 1968, quando Edwards assistiu a uma palestra que Steptoe proferiu sobre laparoscopia na Royal Society of Medicine, em Londres (Edwards, 1965; 2004; Johnson, 2010).
A primeira gravidez obtida através da FIV em humanos foi uma gravidez tubária, em uma mulher de 35 anos com infertilidade por fator tubário, em 1976. Após estimulação ovariana, quatro oócitos foram obtidos. Algumas horas depois um oócito foi fertilizado (clivado até o estágio de 16 células), mas resultou em gestação ectópica removida com 13 semanas (Steptoe & Edwards, 1976). Edwards e Steptoe trabalhavam com o casal infértil Lesley e John Brown. numa tentativa bem sucedida, um oócito obtido por ciclo natural foi fertilizado in vitro e à meia-noite um embrião de oito células foi transferido. O verdadeiro marco que estabeleceu o início de uma nova era na Medicina Reprodutiva deu-se com o nascimento de Louise Joy Brown, em 25 de julho de 1978 (Steptoe & Edwards 1978). Esse marco ocorreu um século após as primeiras tentativas de fertilização in vitro em mamíferos, realizada por Schenk em 1878.
No início da década de 80 um grupo australiano foi o primeiro a repetir o sucesso da FIV. nascia então Candice Reed, após transferência de um oócito no estágio de oito células, originário de um único oócito aspirado por laparoscopia, durante ciclo natural (Lopata et al., 1980). Os pesquisadores Howard W. Jones e Georgeanna Jones dos Estados Unidos obtiveram oócitos por indução da ovulação com gonadotrofina menopausal humana (hMG - human Menopausal Gonadotropins) e hCG, e em 1981 nasceu Elizabeth Carr Comeau (Jones et al., 1982).
Ana Paula Bettencourt Caldeira foi o primeiro bebê gerado por FIV no Brasil e na América Latina, aos 07 de outubro de 1984 em São Paulo. no mesmo ano nasceu em Melbourne na Austrália, Zoe Leyland, o primeiro bebê desenvolvido a partir de um embrião descongelado, por Alan Trounson e Carl Wood (Trounson et al., 1983).
Novas técnicas para punção folicular foram propostas além da laparoscopia realizada com anestesia geral e entubação, elevando os riscos do procedimento e internação. A ultrassonografia passou a ser utilizada para guiar uma agulha através da parede vaginal para recuperação dos oócitos nos ovários. Usando esse método, os riscos associados com a anestesia necessária para a laparoscopia, bem como os custos do procedimento foram consideravelmente reduzidos (Dellenbach et al., 1985). O uso do ultrassom na punção folicular alcançou resultados indiscutíveis e essa evolução ocorreu simultaneamente com o monitoramento da ovulação e o desenvolvimento dos equipamentos que permitiam acompanhar o ciclo (Passos, 2004).
O conhecimento endocrinológico também evoluiu nessa época, melhorando a qualidade da estimulação da ovulação com a perspectiva de desenvolvimento folicular adequado, com menos riscos. Exames de sangue para dosagens hormonais também eram solicitados. Apesar de Steptoe e Edwards terem usado gonadotrofinas no fim da década de 70, somente em 1981 houve relato da primeira gestação com o emprego destas medicações em conjunto com a FIV (Trounson et al., 1981). Assim, a FIV se firmou como um procedimento clínico utilizado por centros no mundo todo.
OUTRAS PERSPECTIVAS DE USO DAS TRAS
A doação de oócitos foi indicada para casos de insuficiência ovariana, menopausa precoce, disgenesia ovariana ou ooforectomias bilaterais, mas também nas situações de presença da função ovariana, mas com falhas repetidas. A primeira gestação proveniente de oócitos doados ocorreu em uma mulher sem ovários, mas resultou em abortamento no primeiro trimestre (Trounson et al., 1983). Alguns meses depois, Lutjen et al., relataram o nascimento de uma criança proveniente de oócito doado anonimamente para tratamento de insuficiência ovariana precoce, além de ser o pioneiro a usar estimulação ovariana controlada para a doadora (Lutjen et al., 1984). Em 1985, Quinn et al., publicaram uma fórmula que mimetizava o fluido das trompas humanas, chamando de meio de cultura HTF - Human Tubal Fuid, imitando o ambiente in vivo ao qual o embrião fica exposto (Quinn et al., 1985).
Na década de 80 outras formas de fertilização realizada em laboratório, consideradas mais complexas, foram descritas. Fernandez et al., publicaram a primeira gestação obtida por transferência intra tubária de gametas (GIFT), em 1984, no Chile (Fernandez et al., 1985). Contudo, os primeiros relatos sobre micromanipulação de gametas são do final da década de 70 quando Uehara e Yanagimachi injetaram o núcleo isolado do espermatozóide em um oócito de hamster (Uehara & Yanagimachi, 1976). A microinjeção de espermatozóide sob a zona pelúcida (microinjection of a few spermatozoids under the pellucid zone) foi proposta por ng et al., em Singapura que relataram o primeiro nascimento com uso dessa técnica (ng et al., 1988).
A partir desses trabalhos Lanzendorf et al., realizaram a primeira avaliação pré-clínica da formação de prónúcleos por microinjeção de espermatozóide dentro do oócito e, assim, surgiu a injeção intracitoplasmática do espermatozóide (ICSI - IntraCytoplasmic Sperm Injection), onde um único espermatozóide é injetado dentro do oócito maduro (Lanzendorf et al., 1988). Em 1992 Palermo et al., relataram sucesso após o uso de ICSI em 47 oócitos maduros, verificando que 38 permaneceram intactos após a microinjeção (Palermo et al., 1992). Quatro gestações foram obtidas após 8 ciclos de tratamento, sendo duas gestações únicas, uma gemelar e um aborto pré-clínico. Já em 1993 utilizaram a ICSI em 716 oócitos (em Metáfase II) para tratamento do fator masculino e também com TESE (Testicular Sperm Extraction) para casos de azoospermia não obstrutiva (Palermo et al., 1993; Devroey et al., 1995).
O sucesso da ICSI abriu novas perspectivas principalmente para homens considerados até então como “estéreis”. Os primeiros casos de gravidez com espermatozóides aspirados do epidídimo foram obtidos entre o final da década de 80 utilizando a FIV. Entretanto, o baixo número de espermatozóides obtidos e com motilidade reduzida causavam resultados desanimadores. Com o surgimento da ICSI as taxas de sucesso aumentaram passando de 11% com a FIV convencional, para 30-35% com a ICSI (Passos, 2004).
O microscópio com micromanipulador utilizado para ICSI possibilita um aumento de 400 vezes para seleção do espermatozóide com melhor morfologia. O grupo do professor Benjamin Bartoov, bioquímico e andrologista israelense especialista em morfologia espermática, relataram que quanto mais alterações morfológicas no espermatozóide, maior a incidência de alterações genéticas nestes e, consequentemente, piores taxas de sucesso. Desenvolveram então o microscópio micromanipulador de Alta Magnificação ou Super-ICSI como é chamado no Brasil, e injeção intracitoplasmática de espermatozóides selecionados morfologicamente (Intracytoplasmic Morphology Selected Sperm Injection - IMSI) como é conhecido internacionalmente, que amplifica 6.000 vezes o espermatozóide possibilitando uma análise minuciosa para seleção da melhor morfologia (Bartoov et al., 2003). Outros avanços foram obtidos após inúmeras pesquisas. Durante o 23o Encontro anual da European Society of Human Reproduction and Embryology realizado em 2007, em Lyon - França, trabalhos apresentados enfatizavam a criopreservação de gônadas e gametas como um procedimento promissor (ESHRE, 2007). A maturação in vitro de oócitos (IVM - In Vitro Maturation) é uma técnica que consiste na maturação dos oócitos em laboratório, e os primeiros resultados brasileiros de sucesso aconteceram em 2007 (Frantz et al., 2010).
Houve também a evolução das técnicas de análises genéticas tanto para os pais quanto dos embriões em formação através do Diagnostico Genético Pré-Implantacional (PGD - Pre-implantation Genetic Diagnosis) ou triagem préimplantação (PGS - Pre-implantation Genetic Screening). O núcleo de um blastômero é analisado para desordens genéticas, o que beneficia casais com alto risco genético de ocorrência de doenças de etiologia autossômica dominante ou recessiva. A constituição cromossômica destes blastômeros pode ser analisada por testes como a hibridização fluorescente in situ (FISH - Fluorescent in situ hybridization) ou a reação em cadeia da polimerase (PCR - Polimerase Chain Reaction). Os casais também podem procurar ajuda de profissionais em relação ao aconselhamento genético, que auxilia no esclarecimento sobre as chances de ocorrência das doenças genéticas.
ATUAL SITUAÇÃO NO BRASIL
As TRAs são regulamentadas no Brasil pelas normas éticas definidas na resolução do Conselho Federal de Medicina (CFM), última atualização publicada em 06 de janeiro de 2011 no Diário Oficial da União. A versão anterior já apresentava grandes avanços e o CFM sentiu a necessidade de se adaptar à evolução tecnológica e modificações de comportamento social. Ponderou sobre a reprodução assistida postmortem, desde que comprovada autorização prévia. Permite que as TRAs sejam desenvolvidas em todas as pessoas, independentemente de estado civil ou orientação sexual, já que a medicina não tem preconceitos e deve respeitar todos de maneira igual. Define o número máximo de embriões a serem transferidos, já que a recomendação dependerá da idade da paciente, não podendo ser superior a quatro embriões. E permanecem as diretrizes éticas como a proibição de que as técnicas de reprodução sejam aplicadas com a intenção de selecionar sexo ou qualquer característica biológica do futuro filho.
Existem vários centros de Reprodução Humana no país, a grande maioria particular e poucos serviços públicos gratuitos, alguns cobram o custo do material utilizado e os pacientes também arcam com a medicação. Essa situação ainda se agrava quando se observa que além do insuficiente número de centros públicos 80% desses estão em São Paulo e distribuídos de maneira desigual no próprio Estado e no País como um todo (RedLara, 2006).
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Um dos grandes desafios para o século 21 é tornar as técnicas acessíveis àqueles que delas possam se beneficiar. Avanços marcantes ocorreram com a inclusão de novos equipamentos, meios de cultura e reagentes melhorados, técnicas modernas de transferência embrionária e a análise do DNA tanto dos gametas quanto do embrião já formado. Um dos desafios atuais é a redução do número de gestações múltiplas e aumento da taxa de gravidez. Todo avanço das Técnicas de Reprodução Assistida geram consequências que devem ser regulamentadas por órgãos competentes. Contudo, o código civil brasileiro ainda é insuficiente, não abrangendo as novas realidades como a formação dos novos laços sociais, ou a doação de gametas e embriões. Décadas se passaram desde o primeiro sucesso, mas o ideal continua sendo o mesmo até os dias atuais: realizar o sonho de constituir uma família!
Chang MC. Fertilization of rabbit ova in vitro. nature. 1959;184:466-467.
Edwards RG. Maturation in vitro of human ovarian oocytes. Lancet. 1965;2:926-929.
McClean D, Rowlands IW. Role of hyaluronidase in fertilization. nature. 1942;150:627-628.
Steptoe PC, Edwards RG. Birth after reimplantation of human embryo. Lancet. 1978;312:366.